Mengevaluasi citra RGB dan multispektral yang ditangkap UAV sebagai proksi untuk penilaian visual bercak daun pada kacang tanah yang dibudidayakan

Abstrak
Bercak daun merupakan penyakit yang merusak pada kacang tanah yang dibudidayakan ( Arachis hypogaea L.) yang dapat menyebabkan kerugian hasil panen yang signifikan tanpa pengendalian kimia. Beberapa gejala penyakit, dua organisme penyebab, lingkungan pengujian yang tidak konsisten, dan interaksi genotipe dengan lingkungan merupakan komponen yang membuat pemuliaan kacang tanah yang tahan bercak daun menjadi tantangan. Untuk lebih memahami penyakit ini, dan memperoleh kemajuan dalam pemuliaan untuk ketahanan terhadap penyakit, strategi fenotipe yang akurat dan objektif harus diterapkan. Dalam karya ini, data yang diperoleh dari pemindaian daun, citra merah, hijau, biru, dan multispektral yang diambil oleh kendaraan udara yang tidak berpenghuni dievaluasi sebagai pengganti skala penilaian visual subjektif yang digunakan saat ini. Prosedur operasi standar dirinci untuk semua metode digital yang dievaluasi dalam makalah ini, dan semua fenotipe digital dikarakterisasi sepenuhnya dengan statistik deskriptif. Studi kepentingan fitur dan pembuktian konsep post hoc dilakukan untuk mengevaluasi lebih lanjut metode digital baru. Pada akhirnya, “indeks ketahanan atmosfer yang tampak” dipilih sebagai proksi yang paling tepat untuk penilaian visual dan harus digunakan oleh para peneliti dan pemulia tanaman dalam komunitas kacang tanah untuk evaluasi objektif ketahanan terhadap bercak daun.

Ringkasan Bahasa Sederhana
Penyakit bercak daun menyebabkan kerusakan besar pada tanaman kacang tanah di seluruh dunia, berpotensi memangkas hasil panen petani hingga setengahnya tanpa perawatan kimia yang mahal. Saat ini, para ilmuwan menilai kerusakan bercak daun dengan inspeksi visual, yang memakan waktu dan subjektif. Studi ini menguji apakah gambar yang diambil oleh drone dapat memberikan cara yang lebih baik untuk mengukur kerusakan bercak daun di ladang kacang tanah. Para peneliti membandingkan berbagai metode, termasuk kamera biasa, kamera penginderaan tanaman khusus, dan pemindaian daun, untuk melihat mana yang paling berhasil. Pengukuran yang disebut VARI (indeks tahan atmosfer yang terlihat), dihitung dari foto drone biasa, paling akurat cocok dengan penilaian visual tradisional. Penemuan ini berarti bahwa drone dengan kamera standar dapat dengan cepat dan objektif mengukur kerusakan bercak daun di seluruh ladang. Metode baru ini akan membantu para ilmuwan mengembangkan varietas kacang tanah yang lebih tahan terhadap penyakit bercak daun, yang pada akhirnya menguntungkan petani melalui pengurangan penggunaan bahan kimia dan peningkatan hasil panen.

Singkatan
GWAS
studi asosiasi genom secara luas
Kamera
deteksi cahaya dan jangkauan
Bahasa Inggris
bercak daun
MTVI-1
indeks vegetasi segitiga yang dimodifikasi 1
Universitas Negeri Carolina Utara
Universitas Negeri Carolina Utara
Penyakit Menular Seksual (NDVI)
indeks vegetasi perbedaan yang dinormalkan
PB&G
Pemuliaan dan Genetika Kacang Tanah
Bahasa Indonesia: PBRS
Stasiun Penelitian Sabuk Kacang
Bahan PVC
polivinil klorida
QTL
lokus sifat kuantitatif
Bahasa Inggris: RGB
merah, hijau, biru
RTK
kinematika waktu nyata
TVI
indeks vegetasi segitiga
Pesawat tanpa awak
kendaraan udara tak berpenghuni
BERBAGAI
indeks ketahanan atmosfer yang terlihat
Bahasa Indonesia: Ke-VI
indeks vegetasi
1. PENDAHULUAN
Kacang tanah ( Arachis hypogaea L.) tumbuh secara global antara garis lintang 47° Utara dan 35° Selatan (Peanut Explorer, 2023 ) sebagai sumber protein dan minyak. Bercak daun (LS) adalah penyakit yang paling merusak pada kacang tanah yang dibudidayakan secara internasional (Porter et al., 1997 ; Smith & Litterall, 1980 ; York et al., 1994 ) dan disebabkan oleh dua ascomycetes, Passalora arachidicola (Hori) Braun dan Nothopassalora personata (Berk. & MA Curtis) U. Braun, C. Nakash., Videira & Crous. LS memiliki dua gejala bertahap di atas tanah; penyakit ini bermanifestasi terutama sebagai lesi daun yang diikuti oleh pengguguran daun tajuk. Tanpa fungisida, yang biayanya sekitar $250/ha (Anco et al., 2020 ), produsen kacang tanah dapat kehilangan hingga setengah dari hasil panen mereka (Porter et al., 1997 ; Smith & Litterall, 1980 ). Ketahanan penyakit terhadap patogen LS telah menjadi target pemuliaan di antara program pemuliaan kacang tanah selama lebih dari 40 tahun (Chiteka et al., 1988 ). Lambatnya kemajuan menuju tujuan ini disebabkan oleh kompleksitas dalam biologi penyakit, ketidakkonsistenan dalam lingkungan pengujian, dan metode evaluasi penyakit yang tidak sesuai.

Secara biologis, sifat kuantitatif dari sifat dan interaksi genotipe melalui lingkungan membuat pemuliaan untuk ketahanan LS menjadi tantangan dalam banyak program pemuliaan kacang tanah (Dang et al., 2021 ; Han et al., 2018 ). Selain itu, variasi perancu dalam galur kacang tanah, seperti variasi dalam profil kematangan atau arsitektur tanaman, dapat mengaburkan mekanisme ketahanan yang sebenarnya (Anco et al., 2020 ; Gonzales et al., 2023 ; DL Jordan et al., 2016 ). Pada saat penulisan, tidak ada mekanisme ketahanan spesifik yang telah diidentifikasi (H. Zhang, Chu et al., 2020 ). Mengenai studi lapangan, kondisi lingkungan yang tidak konsisten dan inokulum yang tidak konsisten menimbulkan tantangan dalam mempelajari LS. Dalam hal metode evaluasi, Skala Florida telah menjadi cara standar untuk menilai gejala LS dalam kondisi lapangan sejak dibuat pada tahun 1988 (Chiteka et al., 1988 ). Skala Florida tidak membedakan antara patogen penyebab, juga tidak memisahkan gejala penyakit yang berbeda, yaitu lesi daun versus pengguguran daun (Lamon et al., 2020 ). Penilaian visual mulai ditinggalkan dalam pemuliaan tanaman karena penilaian ini subjektif dan memakan waktu. Selain itu, penilaian LS dilakukan pada skala ordinal, sehingga mengurangi daya statistik, meningkatkan penggunaan sumber daya komputasi, dan memerlukan perangkat lunak khusus untuk menganalisis eksperimen (Bi et al., 2021 ; German et al., 2020 ; Verhulst & Neale, 2021 ).

Masalah subjektivitas, penggunaan waktu, dan tipe data yang disebutkan di atas yang terkait dengan penilaian visual dapat dipecahkan melalui penggunaan platform fenotipe throughput tinggi dan sensor terkait, yang semakin mudah diakses. Fenotipe digital dalam bentuk citra menawarkan keuntungan tambahan berupa pengarsipan data mentah (McDonald et al., 2022 ). Data dapat dianalisis ulang saat teknik analisis citra ditingkatkan, dan data yang diarsipkan ini dapat dimasukkan ke dalam meta-analisis. Kendaraan udara tak berawak (UAV) menghadirkan platform throughput tinggi untuk memasang sensor untuk fenotipe non-destruktif. Deteksi cahaya dan pengukuran jarak (LiDAR), sensor merah, hijau, biru (RGB), dan multi- atau hiper-spektral dapat menghasilkan informasi tentang biomassa, kuantifikasi objek, dan tanda reflektansi (Jimenez-Berni et al., 2018 ). Tekanan penyakit sering kali menyebabkan perubahan pada biomassa, karakteristik objek, dan tanda reflektansi, yang dapat dimanfaatkan oleh komunitas penelitian untuk kuantifikasi gejala penyakit (Guo et al., 2021 ; McDonald et al., 2022 ; Serrago et al., 2009 ).

Untuk mengatasi komponen biologis dan lingkungan yang mengaburkan kemajuan menuju resistensi LS, cara ilmuwan mengevaluasi LS harus berubah. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk menentukan apakah metode fenotipe berbasis gambar dapat bertindak sebagai proksi untuk metode penilaian visual tradisional. Studi ini menyediakan prosedur operasi standar untuk mengevaluasi LS melalui fenotipe digital, menjelaskan hubungan antara penilaian visual dan fenotipe digital, dan menentukan pentingnya fitur dengan memodelkan penilaian visual. Studi asosiasi genom-lebar (GWAS) dilakukan sebagai bukti konsep untuk mengevaluasi apakah fenotipe digital dapat memberikan penanda signifikan yang sama dengan Skala Florida tradisional. Pemilihan ambang batas post hoc diterapkan sebagai eksperimen bukti konsep kedua untuk menentukan apakah individu yang sama akan dipilih menggunakan metodologi fenotipe yang berbeda.

2 BAHAN DAN METODE
2.1 Pemilihan plasma nutfah dan desain lapangan
2.1.1 Plasma Nutfah
Populasi 264 genotipe kacang tanah allotetraploid dipilih untuk penelitian ini karena nilainya bagi program Pemuliaan dan Genetika Kacang Tanah (PB&G) Universitas Negeri Carolina Utara (NCSU). Populasi tersebut terdiri dari 12 kultivar PB&G NCSU, 165 galur pemuliaan, 85 galur dengan introgresi spesies liar, dan dua galur introgresi tanaman (Tabel S1 ). Dengan memilih genotipe yang maju dan sangat terkait, temuan apa pun dari penelitian ini dapat dengan cepat dimasukkan ke dalam aktivitas program PB&G. Selain itu, 264 galur kacang tanah tersebut mewakili gradien ketahanan terhadap fenotipe yang rentan sebagai respons terhadap tekanan penyakit LS.

2.1.2 Desain lapangan
Populasi 264 genotipe dievaluasi di Peanut Belt Research Station (PBRS, Lewiston-Woodville, NC) dan Upper Coastal Plains Research Station (Rocky Mount, NC, 66,9 km dari PBRS), selama musim panas tahun 2021 dan 2022, menciptakan empat kombinasi unik tahun dan lokasi, yang selanjutnya disebut sebagai eksperimen. Setiap eksperimen memiliki dua replikasi, dan setiap replikasi ditanam dalam rancangan blok lengkap acak. Setiap genotipe ditanam sebagai plot dua baris dengan dimensi berikut: 90 cm pusat baris dan 7,3 m panjang baris. Sebuah lorong sepanjang 2,1 m memisahkan rentang. Selain tidak adanya fungisida topikal, ladang dikelola dengan praktik budaya standar untuk wilayah tersebut. Benih diperlakukan dengan CruiserMaxx (Syngenta) selama penanaman untuk mengembangkan jumlah tegakan yang seragam. Untuk memfasilitasi georeferensi, dalam waktu 30 hari setelah penanaman, enam hingga sembilan titik kontrol tanah dipasang di ladang dengan cara yang seragam. Titik kontrol tanah dibuat dari pipa polivinil klorida (PVC) berdiameter 5,08 cm dan panjang 100 cm dengan tutup PVC 5,08 cm. Pipa ditancapkan ke dalam tanah hingga tutupnya rata dengan permukaan tanah. Penerima kinematik waktu nyata (RTK) Emlid Reach RS2 (Emlid) digunakan untuk mengukur koordinat x , y , dan z dari setiap titik kontrol tanah.

2.2 Jalur fenotipe
Fenotipe yang disajikan dalam penelitian ini dikumpulkan saat kacang tanah berada dalam tahap pertumbuhan R8 (Subrahmanyam et al., 1995 ) atau dianggap matang dan siap dipanen. Untuk perhitungan pengguguran daun saja, UAV diterbangkan pada awal kematangan atau R7 untuk menangkap perubahan yang relatif terhadap tahap pertumbuhan R8. Penilaian visual, pemindaian daun, dan data UAV ( Informasi Pendukung dalam repositori GitHub) semuanya ditangkap dalam waktu 48 jam satu sama lain. LS awal dan akhir dinilai sebagai satu penyakit komposit ( https://github.com/cassondranewman/LS-imagery/tree/main/Supplementary_Material ).

2.2.1 Penilaian visual
Semua penilaian visual dikumpulkan oleh penilai berpengalaman yang sama. Penilaian visual dikumpulkan berdasarkan gejala LS menggunakan skala 9 poin yang dimodifikasi seperti yang disajikan oleh Subrahmanyam et al. ( 1995 ) di setiap plot setiap percobaan, di mana 1 menunjukkan tidak ada lesi visual, 5 menunjukkan lesi yang menutupi seluruh profil tanaman dengan pengguguran daun lebih dari 50% pada daun bagian bawah, dan 9 menunjukkan lesi yang menutupi seluruh profil tanaman dengan pengguguran daun hampir 100%.

2.2.2 Pemindaian daun dengan throughput rendah
Untuk setiap genotipe, delapan helai daun (setara dengan 32 helai daun) dipilih secara acak dari cabang ketiga di bawah bagian atas tanaman, termasuk hanya vegetasi yang tidak berbatasan. Daun ditempatkan di Whirl-Pak dari Weber Scientific dan didinginkan hingga pemindaian. Daun dipindai dalam waktu 7 hari sejak pengumpulan di lapangan untuk menghindari pengeringan dan perubahan warna. Helai daun disusun sedemikian rupa sehingga tidak terjadi tumpang tindih, dan sisi adaksial daun dipindai berwarna dengan Epson DS-50000 Flatbed Scanner. Jumlah lesi dan luas lesi pada basis plot dihitung dalam Python versi 3.6.10 (sesuai dengan Skrip Informasi Pendukung 1 yang terdapat di repositori GitHub proyek; https://github.com/cassondranewman/LS-imagery/tree/main/Supplementary_Material ).

2.2.3 Gambar RGB yang diambil UAV
Sebelum setiap penerbangan, target PVC 15 cm 2 yang diwarnai dengan pola kotak-kotak hitam dan putih dipusatkan di semua titik kontrol darat yang disurvei RTK yang ada di lapangan. UAV DJI Matrice 300 RTK diterbangkan dengan lensa DJI Zenmuse P1 35 mm untuk menangkap gambar RGB warna asli. UAV diterbangkan pada ketinggian 30 m, dengan kecepatan 12,6 km/jam (jarak sampel darat 0,38 cm/px). Rencana penerbangan DJI Pilot memastikan tumpang tindih gambar 80/80 untuk memfasilitasi penggabungan gambar. Gambar dari setiap penerbangan diimpor ke Metashape versi 1.6. Menggunakan alur kerja default, gambar disejajarkan, awan titik padat dan model permukaan digital dibangun, dan ortomosaik dibuat. Posisi RTK yang diketahui dari titik kontrol darat diimpor dan digunakan untuk memperbaiki produk ortomosaik secara geometris. Ortomosaik diekspor ke sistem koordinat proyeksi EPSG:2264 dan diimpor ke ArcGIS Pro versi 2.3.0 untuk segmentasi plot, pelabelan plot, penghapusan piksel tanah, perhitungan persentase pengguguran daun (selisih antara persentase tajuk R7 dan R8), dan ekstraksi nilai reflektansi pada basis plot (Informasi Pendukung S1 ).

2.2.4 Citra multispektral yang ditangkap UAV
Bahasa Indonesia: Dalam penerbangan terpisah dari koleksi gambar RGB, DJI Matrice 300 RTK UAV yang sama diterbangkan dengan sensor ganda RedEdge-MX 10-band dari Micasense. Gambar 1 menunjukkan lokasi panjang gelombang dan lebar yang ditangkap oleh setiap band. Segera sebelum setiap penerbangan UAV, panel reflektansi terkalibrasi Micasense RP06 diambil gambarnya dengan sensor ganda RedEdge-P. UAV diterbangkan pada ketinggian 40 m, dengan kecepatan 12,6 km/jam (jarak sampel tanah 2,73 cm/px). Rencana penerbangan DJI Pilot memastikan tumpang tindih gambar 80/80 untuk memfasilitasi penggabungan gambar. Metashape versi 1.6 digunakan seperti pada Bagian 2.2.3 , dengan modifikasi berikut: gambar dikenakan kalibrasi warna radiometrik untuk menghasilkan reflektansi permukaan absolut menggunakan gambar pra-penerbangan dari panel reflektansi terkalibrasi sebelum penyelarasan gambar (Informasi Pendukung S1 ). ArcGIS Pro versi 2.3.0 (ESRI, 2011 ) digunakan untuk segmentasi plot, pelabelan plot, penghapusan piksel tanah, dan ekstraksi nilai reflektansi berdasarkan plot (Informasi Pendukung S1 ). Dalam Python versi 3.6.10 dengan statsmodels versi 0.13.2 (Seabold & Perktold, 2010 ), analisis varians (ANOVA) digunakan untuk menentukan apakah salah satu dari sembilan kelas penilaian visual berbeda secara signifikan pada sepuluh panjang gelombang yang direkam oleh kamera multispektral.

2.2.5 Indeks vegetasi multispektral dan berbasis RGB
Angka-angka digital yang mewakili reflektansi dihitung dan diringkas berdasarkan rata-rata plot dari citra UAV (Bagian 2.2.3 dan 2.2.4 ). Nilai-nilai ini dibaca ke dalam Python versi 3.6.10 untuk perhitungan indeks vegetasi (VI) (sesuai dengan Skrip Informasi Pendukung 2 yang terdapat dalam repositori GitHub proyek; https://github.com/cassondranewman/LS-imagery/tree/main/Supplementary_Material ).

Tabel 1 mencantumkan semua VI yang dihitung dan pita terkait yang digunakan (Blackburn, 1998 ; Broge & Leblanc, 2001 ; Chappelle et al., 1992 ; Daughtry et al., 2000 ; Elvidge & Chen, 1995 ; Gitelson & Merzlyak, 1994 ; Gitelson et al., 2002 ; Haboudane et al., 2004 ; AR Huete, 1988 ; A. Huete et al., 2002 ; CF Jordan, 1969 ).

TABEL 1. Tabel ini menampilkan indeks vegetatif yang dihitung dan dievaluasi dalam penelitian ini.

Catatan : Persamaan untuk setiap indeks tercantum dalam Skrip Informasi Pendukung 2. Nama indeks diikuti oleh kolom di sebelah kiri yang mencantumkan singkatan masing-masing yang digunakan dalam naskah ini. Header multispektral berada di atas semua pita yang dikumpulkan dari sensor ganda RedEdge-P (nomor pita menunjukkan panjang gelombang pusatnya dalam nanometer) dan header sensor RGB berada di atas semua pita yang dikumpulkan dari lensa DJI Zenmuse P1 35 mm. Kotak kuning yang berisi "ya" menunjukkan bahwa pita tersebut digunakan dalam rumus indeks yang sesuai.
Singkatan: RGB, merah, hijau, biru.

2.3 Genotipe
Jaringan daun muda yang belum berkembang dibekukan dengan cepat menggunakan nitrogen cair untuk 264 individu. Kit Tanaman Qiagen DNeasy digunakan untuk ekstraksi DNA, dan kuantifikasi dilakukan dengan sistem QuantiFluor Promega. Konsentrasi DNA dinormalisasi menjadi 5 ng/µL menggunakan robot Opentrons OT-2 dan total DNA 25 ng (5 µL dari 5 ng/µL) digunakan untuk input. Pengurutan dilakukan menggunakan alur kerja TECAN Allegro Targeted Genotyping V2 dengan set probe khusus sebanyak 22.995 probe (subset dari Newman et al. [ 2023 ]). Platform Illumina Novaseq 6000 digunakan untuk menghasilkan 150 pasangan basa, pembacaan ujung berpasangan. Pemanggilan varian mengikuti alur penemuan varian pendek standar seperti yang disajikan dalam Newman et al . Dengan menggunakan PLINK 2.0 (Chang et al., 2015 ), situs dipertahankan jika bersifat biallelik, memiliki frekuensi alel minor minimum 0,01, dan jika situs cocok dengan situs varian yang ditargetkan oleh probe TECAN. Data yang hilang diimputasi dengan “LDKNNiImputationPlugin” oleh Tassel versi 5 (Bradbury et al., 2007 ) menggunakan nilai default.

2.4 Menyelidiki fitur
2.4.1 Karakterisasi fitur
Dalam manuskrip ini, semua data yang berasal dari citra akan disebut sebagai fitur. SciKitLearn (Pedregosa et al., 2022 ) versi 1.3 digunakan dalam Python versi 3.6.10 untuk menskalakan dan memusatkan penilaian visual dan semua fitur. SciPy (Virtanen et al., 2020 ) versi 1.9.1 digunakan untuk menguji kenormalan fitur yang ditransformasikan menggunakan uji hipotesis Shapiro Wilk. Koefisien korelasi peringkat Spearman dihitung untuk semua pasangan fitur dan divisualisasikan dengan clustermap Seaborn (Waskom, 2021 ) versi 0.13.0 dengan pengelompokan yang ditentukan oleh jarak Euclidean default.

2.4.2 Pentingnya Fitur
SciKitLearn (Pedregosa et al., 2022 ) versi 1.3 digunakan dalam Python versi 3.6.10 untuk menskalakan dan memusatkan fitur serta menjalankan analisis komponen utama. Seaborn (Waskom, 2021 ) versi 0.13.0 digunakan untuk visualisasi peta panas. Paket “ordinalForest” (Hornung, 2020 ) versi 2.4-3 dijalankan dengan R versi 4.2.2 untuk menentukan pentingnya fitur fenotipe digital relatif terhadap peringkat visual tradisional ordinal. Hutan acak ordinal dijalankan secara terpisah untuk setiap sensor: pemindai, RGB, dan multispektral. Dalam setiap kasus, model tersebut dipasang pada data pelatihan (yang terdiri dari tiga eksperimen) dan diuji pada eksperimen “left out”. Ini diulang tiga kali tambahan menggunakan lingkungan yang berbeda sebagai pengujian. Hasil dari keempat model dirata-ratakan untuk menghasilkan metrik kinerja akhir dan pentingnya fitur. ANOVA dan perbedaan signifikansi jujur ​​Tukey digunakan untuk menampilkan perbedaan signifikan ( α = 0,05) antara sembilan kelompok penilaian visual untuk ketiga fitur digital teratas.

2.5 Studi pembuktian konsep
2.5.1 Studi asosiasi genom secara luas
Untuk memahami peran eksperimen pada respons ordinal dari penilaian visual, pemodelan tautan kumulatif digunakan dalam R versi 4.2.2 dengan paket “Ordinal” (Christensen, 2022 ). Penilaian visual dan semua fitur digital lainnya diperlakukan sebagai numerik untuk analisis yang tersisa. Untuk menyelidiki lebih lanjut signifikansi eksperimen pada penilaian visual, model campuran dipasang dalam R versi 4.2.2 dengan lmerTest::lmer (Kuznetsova et al., 2017 ) sebagai berikut:

di mana μ adalah intersep, Y ijk adalah peringkat visual, G i adalah efek tetap genotipe, E j adalah efek tetap eksperimen, GE ij adalah interaksi tetap antara genotipe dan eksperimen, ER jk adalah interaksi acak antara eksperimen dan replikasi ( R ), dan e ijk adalah efek acak kesalahan tingkat plot. Keempat eksperimen digabungkan dengan estimasi linier tak bias terbaik, dan estimasi ini diberikan ke GWAS sebagai input. GWAS dijalankan menggunakan implementasi GAPIT (Genome Association and Prediction Integrated Tool) versi 3 (Wang & Zhang, 2021 ) dari BLINK (Bayesian-information and Linkage-disequilibrium Iteratively Nested Keyway; Huang et al., 2019 ). GWAS dilakukan menggunakan peringkat visual dan untuk tiga fitur peringkat tertinggi dari Bagian 2.4.2 . Empat komponen utama diberikan ke model GAPIT untuk mengendalikan substruktur populasi. Pemangkasan ketidakseimbangan keterkaitan situs varian dilakukan dalam paket SNPRelate versi 3.13 versi R versi 4.2.2 (Zheng et al., 2012 ) dengan ambang batas 0,2 dan jendela 500 kb. Jumlah situs yang tersisa digunakan untuk menghitung koreksi perbandingan ganda Bonferroni yang akan digunakan pada ambang batas signifikansi dalam GWAS. Visualisasi hasil GWAS dilakukan dengan CMplot versi 4.4.3 (Yin et al., 2021 ).
2.5.2 Seleksi sintetis post hoc
Dengan menggunakan masing-masing tiga fitur dengan peringkat tertinggi dari Bagian 2.4.2 dan skor penilaian visual, pemilihan ambang batas diterapkan pada populasi kacang tanah sebanyak 264 baris. Pemilihan ambang batas diterapkan pada estimasi linier tak bias terbaik yang dihitung di Bagian 2.5.1 .

3 HASIL DAN PEMBAHASAN
3.1 Karakterisasi strategi fenotipe
Semua level (1–9) dari penilaian visual diamati dalam setiap percobaan kecuali untuk lokasi PBRS pada tahun 2021, yang tidak memiliki level 9 (Gambar 2A ). Namun, tidak ada plot yang mengalami pengguguran daun secara menyeluruh (100%) sehingga mempertahankan kemampuan untuk mengumpulkan sampel daun pada setiap periode penilaian. Mengamati tingkat keparahan penyakit yang tinggi pada satu tahap pertumbuhan (R8), menunjukkan bahwa terdapat inokulum LS yang cukup. Mengamati tingkat keparahan penyakit yang rendah pada percobaan yang sama menunjukkan berbagai tingkat resistensi yang ditunjukkan oleh plasma nutfah. Di semua percobaan (Gambar 2B ), mayoritas pengamatan berada di tengah skala penilaian penyakit, dan ukuran kelas terkecil diamati pada level 9 dan 1.

Penting untuk mengevaluasi kemudahan penerapan setiap teknologi fenotipe untuk memastikan alur kerja layak untuk penggunaan jangka panjang. Tabel 2 membandingkan peringkat visual, pemindaian daun, citra RGB yang ditangkap UAV, dan citra multispektral yang ditangkap UAV seperti yang digunakan dalam studi ini. Dalam hal tenaga kerja dan waktu, peringkat visual dan pemindaian daun memerlukan teknisi untuk berjalan di setiap plot ladang, sementara citra berbasis UAV dapat diambil dari jarak jauh. Pemindaian daun memerlukan waktu pasca-pemrosesan langsung yang cukup besar untuk mengarahkan dan memindai daun. Dalam studi ini, minimal 60 jam dihabiskan untuk pasca-pemrosesan pemindaian daun per eksperimen (setara dengan sekitar 7 m/plot atau 420 d/plot). Tenaga kerja yang diperlukan untuk prosedur fenotipe ini membuatnya tidak praktis untuk penggunaan lebih lanjut. Namun, kode pemindaian daun (Skrip Informasi Pendukung 1 ) yang dirilis dalam manuskrip ini dapat digunakan kembali untuk alur kerja penangkapan ponsel dengan throughput sedang atau untuk merampingkan dan mengurangi tenaga kerja dalam evaluasi uji daun terpisah in vitro. Penangkapan ponsel adalah strategi fenotipe di mana teknisi merekam gambar plot sambil berjalan di lapangan. Alur kerja ponsel akan menghilangkan kebutuhan untuk mengumpulkan, menyimpan, mengarahkan, dan memindai daun. Versi modifikasi dari Skrip Informasi Pendukung 1 dapat digunakan untuk mendapatkan data tentang area dan jumlah lesi berdasarkan gambar ponsel. Uji daun terpisah in vitro untuk menyelidiki resistensi LS adalah alternatif yang lazim untuk fenotipe berbasis lapangan (Foster et al., 1980 ; Gonzales et al., 2023 ; Lamon et al., 2020 ; Melouk & Banks, 1978 ). Teknik ini memungkinkan inokulasi terkontrol Passalora arachidicola atau Nothopassalora personatum , tetapi hanya mewakili gejala penyakit LS pada skala daun. Hambatan saat ini dari pendekatan ini adalah penilaian lesi yang melelahkan (Lamon et al., 2020 ). Skrip yang dirilis dalam studi ini (Skrip Informasi Pendukung 1 ) juga dapat dimodifikasi untuk mengurangi hambatan ini. Dalam hal mengevaluasi kapan fenotipe dapat digunakan, keterbatasan citra yang ditangkap UAV adalah bahwa UAV hanya boleh diterbangkan pada hari tanpa awan dalam waktu 2–3 jam dari tengah hari (Assmann et al., 2019 ) untuk meminimalkan variasi atmosfer dan matahari. Jika desain eksperimen menyerukan interval penilaian yang teratur, kondisi lingkungan dapat mengganggu pengumpulan data. Dalam studi ini, koreksi warna, yang menambahkan langkah lain ke pasca-pemrosesan citra, hanya diterapkan pada citra multispektral yang ditangkap UAV. Keuntungan dari koreksi atmosfer adalah menghasilkan pengukuran reflektansi permukaan absolut, yang merupakan pengukuran yang dapat dibandingkan secara langsung di berbagai waktu, lokasi, dan sensor (Assmann et al., 2019) .). Investasi dalam peralatan (Tabel 2 memberikan perkiraan), pelatihan personel, dan sumber daya komputasi yang dibutuhkan untuk fenotipe berbasis UAV mungkin menjadi penghalang bagi beberapa program penelitian. Perbedaan penting antara penilaian visual, pemindaian daun, dan citra berbasis UAV adalah jenis data keluaran yang diperoleh peneliti. Semua prosedur fenotipe berbasis citra menghasilkan data yang berkelanjutan dan objektif, yang dapat diarsipkan dan digunakan kembali.

TABEL 2. Perbandingan fenotipe bercak daun menggunakan penilaian visual, pemindaian daun, UAV-RGB, dan metode UAV-multispektral.

Catatan : Peringkat dalam tabel ini sesuai dengan metode khusus yang dijelaskan dalam studi ini. Sel merah, jingga, hijau, dan abu-abu masing-masing sesuai dengan karakter yang tidak disukai, sedang, disukai, dan tidak memiliki nilai. Biaya peralatan pemindaian daun adalah biaya satu pemindai flatbed Epson DS-50000. Biaya UAV-RGB dan UAV-multispektral adalah jumlah biaya untuk sensor, drone, penerima RTK, dan perangkat lunak (langganan 1 tahun) sebagaimana dirinci dalam "Bagian 2.2 ." Biaya yang tercantum dalam tabel ini harus dianggap sebagai perkiraan dan hanya digunakan untuk perbandingan jalur fenotipe yang luas.
Singkatan: RGB, merah, hijau, biru; UAV, kendaraan udara tak berawak.
Biaya dihitung tanpa memperhitungkan biaya tenaga kerja. Biaya diestimasikan per Januari 2024 dalam USD, belum termasuk pajak.

Indeks vegetatif (VI) yang digunakan dalam studi ini dipilih jika literatur sebelumnya mendukung utilitas indeks dalam konteks yang sebanding (Chen et al., 2019 ) atau untuk memastikan penyertaan sebagian besar pita dalam VI (Tabel 1 ). Distribusi distribusi fitur berskala dan terpusat ditunjukkan pada Gambar 3. Hipotesis nol normalitas uji Shapiro Wilk ditolak untuk semua fitur selain pita 717 dan indeks vegetatif yang diberi nama khusus 2. Mengingat non-normalitas fitur dan data ordinal dari peringkat visual, koefisien korelasi peringkat Spearman digunakan untuk menyelidiki kekuatan dan arah semua hubungan fitur berpasangan (Gambar 4 ). Ada korelasi tinggi dan positif di antara perbedaan tepi merah yang dinormalkan, indeks vegetatif yang ditingkatkan, indeks vegetasi yang disesuaikan dengan tanah (SAVI), indeks pigmen rasio sederhana, indeks vegetasi perbedaan (DVI), indeks vegetasi segitiga yang dimodifikasi 1 (MTVI-1), pita 740, pita 842, indeks vegetasi segitiga (TVI), indeks tahan atmosfer yang terlihat (VARI), indeks vegetasi perbedaan yang dinormalkan (NDVI), dan rasio sederhana spesifik pigmen b; dan ini memiliki korelasi negatif yang tinggi dengan peringkat visual. VARI adalah satu-satunya fitur dalam klaster ini yang tidak berasal dari citra multispektral. Dari klaster fitur ini, VARI memiliki korelasi tertinggi dengan fitur yang kami minati—”peringkat visual.” Mengabaikan direksionalitas, fitur yang paling berkorelasi signifikan (dan koefisien korelasinya masing-masing) dengan peringkat visual adalah; VARI (0,812), pengguguran daun (0,789), pita 740 (0,784), TVI (0,780), pita 842 (0,779), DVI (0,778), MTVI-1 (0,778), indeks luas daun (0,775), SAVI (0,775), dan NDVI (0,754). Citra RGB yang ditangkap UAV memiliki resolusi spasial yang lebih tinggi (0,38 vs. 2,73 cm/px; Tabel 2 ) dibandingkan dengan citra multispektral yang ditangkap UAV, yang mungkin menjadi alasan mengapa dua fitur turunan RGB (VARI dan pengguguran daun) berkorelasi paling baik dengan peringkat visual.

 

Dua gejala penyakit yang digunakan untuk menyusun penilaian visual (Subrahmanyam et al., 1995 ) adalah pengguguran daun dan keberadaan lesi. Oleh karena itu, penting untuk dicatat bahwa korelasi pengguguran daun, persentase area lesi, dan jumlah lesi terhadap penilaian visual memiliki koefisien korelasi signifikan masing-masing sebesar 0,789, 0,739, dan 0,519. Ini menyiratkan, dengan asumsi bahwa penilaian visual mewakili sebagian besar penilai, bahwa penilaian visual sebagian besar ditentukan oleh pengguguran daun dan area lesi, bukan jumlah lesi yang ada.

Citra multispektral menangkap tanda-tanda reflektansi yang berbeda untuk setiap tingkat keparahan penyakit (Gambar 5 ). ANOVA menunjukkan bahwa ada bukti perbedaan yang signifikan antara kelas di semua 10 panjang gelombang. Puncak reflektansi lokal pada 560 nm dapat diamati, yang cocok dengan literatur (Li et al., 2014 ). Diketahui bahwa panjang gelombang hijau memiliki reflektansi yang lebih tinggi daripada panjang gelombang spektrum tampak lainnya karena panjang gelombang hijau tidak diserap oleh pigmen fitoaktif tanaman (Li et al., 2014 ). Di bagian merah spektrum elektromagnetik (sekitar 650–700 nm), kacang tanah yang bergejala memiliki reflektansi yang lebih tinggi daripada kacang tanah yang tidak bergejala. Di wilayah inframerah dekat yang direkam dalam penelitian ini (sekitar 800–850 nm), peringkatnya terbalik dari apa yang diamati di bagian merah spektrum elektromagnetik. Pengamatan terhadap reflektansi terbesar tanaman sehat di wilayah inframerah dekat sesuai dengan literatur (Chen et al., 2019 ; Guo et al., 2021 ). Selain itu, di wilayah inframerah dekat, perbedaan rata-rata terbesar antara kelas peringkat visual tertinggi dan terendah diamati. Tanaman kacang tanah yang sakit memiliki reflektansi yang berkurang di wilayah inframerah dekat dibandingkan dengan tanaman sehat, karena perubahan struktur jaringan daun dan perubahan hamburan antarmuka “udara-air” (Chen et al., 2019 ; Ustin & Gamon, 2010 ). Selain itu, tanda tangan reflektansi kami dari pita merah dan seterusnya cocok dengan bagan reflektansi hiperspektral tingkat ladang kacang tanah yang dihasilkan dalam pekerjaan sebelumnya (Guan et al., 2022 ). Konsensus umum ini penting karena menandakan bahwa citra multispektral dapat menghasilkan pola yang sepadan dengan citra hiperspektral. Dalam praktiknya, temuan ini berarti para peneliti dapat menghemat biaya pada sensor dan sumber daya komputasi dengan menggunakan sensor multispektral alih-alih sensor hiperspektral.

3.2 Pentingnya Fitur
Lebih dari setengah varians dalam kumpulan data dijelaskan oleh komponen utama pertama, dan empat komponen utama pertama menangkap hampir semua varians dalam kumpulan data (Gambar 6A ). Oleh karena itu, komponen utama pertama diteliti lebih lanjut sebagai cara untuk menentukan pentingnya fitur (Gambar 6B ). Pita multispektral 740 dan 842, bersama dengan beberapa VI memiliki kontribusi yang hampir sama terhadap komponen utama pertama. Oleh karena itu, hasil ini tidak bermakna untuk pemilihan fitur.

Model hutan acak yang sesuai dapat digunakan untuk menentukan peringkat pentingnya fitur input sehubungan dengan fitur target (Hornung, 2020 ; D. Zhang, Wang et al., 2020 ). Dalam studi ini, hutan acak ordinal digunakan karena berkinerja baik dengan data berdimensi tinggi; fitur tidak perlu diskalakan sebelum model; dan model memanfaatkan sifat ordinal dari variabel target. Di sini, fitur target adalah skor peringkat visual. Untuk fenotipe LS rutin dalam penelitian kacang tanah, mengambil semua fenotipe digital (pindaian daun, citra multispektral, dan citra RGB) adalah berlebihan. Oleh karena itu, analisis ini dibatasi oleh jenis sensor; model tersebut disesuaikan secara terpisah untuk pemindaian daun, citra multispektral, dan citra RGB. Tabel 3 mencantumkan metrik kinerja model, dan dua fitur teratas yang dipilih oleh kepentingan variabel permutasi di setiap model. Bahasa Indonesia: Sementara kinerja model rendah dibandingkan dengan upaya penelitian serupa (Chapu et al., 2022 ; Guan et al., 2022 ), ini mungkin disebabkan oleh kumpulan data unik ini, dan perbedaan desain eksperimen dan analisis yang digunakan. Chapu et al. ( 2022 ) menangkap enam dari sembilan tingkat keparahan penyakit, sementara Guan et al. ( 2022 ) menangkap empat dari enam tingkat keparahan penyakit. Studi ini menangkap sembilan dari sembilan tingkat penyakit, yang menghasilkan lebih banyak kelas (nomor kelas dapat memengaruhi kinerja model). Dalam hal kepentingan fitur, menarik untuk dicatat bahwa pita multispektral 740 dinilai sebagai fitur paling prediktif di antara semua pita multispektral dan VI yang dievaluasi. Sebuah studi baru-baru ini menggunakan citra hiperspektral untuk menilai LS kacang tanah, menunjukkan bahwa korelasi tertinggi antara peringkat visual dan reflektansi tajuk terjadi di dekat 730 nm (Chen et al., 2019 ). TVI adalah fitur terpenting kedua yang diidentifikasi dalam model, dan TVI dihitung dari pita 740 bersama dengan pita di daerah hijau dan merah. Untuk menentukan peringkat daya prediktif sensor, semua dari dua fitur teratas yang diidentifikasi (Tabel 3 ) digunakan dalam model hutan ordinal keempat. Tiga fitur teratas dari model keempat, dalam urutan peringkat, adalah VARI, pengguguran daun, dan persentase area lesi (Gambar 7 ). Tidak ada fitur dari sensor multispektral yang termasuk di antara tiga fitur teratas yang diidentifikasi. Model komposit keempat ini memiliki statistik Youden’s J sebesar 0,188, akurasi 0,303, dan akurasi tetangga terdekat sebesar 0,721. Dari Gambar 7 , bahkan fitur digital dengan performa terbaik pun mengalami kesulitan dalam membedakan antara tingkat penilaian visual 1–4. Dalam literatur (Subrahmanyam et al., 1995 ) yang menetapkan skala LS 9 poin, tingkat 1–4 terutama dinilai berdasarkan keberadaan LS pada daun. Dimulai dengan level 5 dan seterusnya, pengguguran daun dipertimbangkan. Hasil empiris (Gambar 7C ) bahwa area lesi tidak memisahkan level 1–3 menyiratkan bahwa skala visual tidak dapat menangkap perbedaan ini di lapangan. Perbedaan signifikan antara jumlah kelompok penilaian visual terbesar dicapai dengan VARI (Gambar 7B ). Karena VARI adalah fitur dengan peringkat teratas dari hutan acak komposit dan terbukti paling baik dalam membedakan antara kelas penilaian visual, fitur ini memiliki dua baris dukungan untuk digunakan sebagai proksi untuk penilaian visual LS.

TABEL 3. Metrik kinerja hutan ordinal dan pentingnya fitur.

Catatan : Tiga model hutan ordinal dipasang secara terpisah untuk pemindaian daun, citra multispektral, dan produk data citra RGB. Tiga kolom pertama menggambarkan kinerja prediksi model. Statistik J Youden dihitung untuk memberikan bobot yang sama pada sembilan tingkat penilaian visual. Kolom keempat dan kelima mencantumkan fitur yang masing-masing mendapat peringkat terbaik dan kedua terbaik.
Singkatan: RGB, merah, hijau, biru; TVI, indeks vegetasi segitiga; VARI, indeks ketahanan atmosfer yang terlihat.

3.3 Studi pembuktian konsep
3.3.1 Studi asosiasi genom secara luas
Untuk menentukan apakah ada efek genotipe yang signifikan berdasarkan percobaan, pemodelan dilakukan. Karena penilaian visual menghasilkan data ordinal, pemodelan dilakukan menggunakan model tautan kumulatif. Namun, model lengkap dengan interaksi genotipe yang diinginkan berdasarkan percobaan, tidak dapat konvergen. Kegagalan untuk konvergen disebabkan oleh kurangnya jumlah observasi yang tepat di setiap tingkat efek utama dan interaksinya. Oleh karena itu, penilaian visual dikode ulang dari kategorikal yang diurutkan menjadi numerik dan dimodelkan dengan model campuran linier. Pada tingkat signifikansi 0,001, interaksi genotipe berdasarkan percobaan dan interaksi percobaan berdasarkan replikasi signifikan secara statistik. Oleh karena itu, percobaan digabungkan dengan estimasi linier tak bias terbaik dan dimasukkan ke dalam GWAS. Untuk lebih mengeksplorasi penggunaan fenotipe digital proksi untuk penilaian visual LS, GWAS dilakukan sebagai studi pembuktian konsep. Tujuan dari percobaan proof-of-concept adalah untuk melihat apakah fitur digital dapat menghasilkan lokus sifat kuantitatif (QTL) yang sama dengan pemeringkatan visual, mengingat bahwa GWAS dijalankan secara identik dan pada data genomik yang sama. Koreksi perbandingan berganda Bonferroni diterapkan berdasarkan jumlah situs varian yang tersisa setelah pemangkasan ketidakseimbangan hubungan (totalnya 2062 situs). Hasil GWAS divisualisasikan dalam Gambar 8. GWAS pada pemeringkatan visual mengidentifikasi satu situs, Bailey II genom versi 1 kromosom 15 pada 158.915.454, yang melewati ambang batas signifikansi. Dari tiga GWAS tambahan yang menggunakan fitur digital teratas, hanya area lesi yang mengidentifikasi lokasi yang sama. Hasil pencocokan adalah serangkaian bukti untuk mendukung area lesi sebagai proksi untuk pemeringkatan visual dalam studi pemetaan. VARI dan GWAS defoliasi berbagi dua QTL signifikan pada kromosom 4 dan 6. Tidak ada penanda signifikan lainnya yang dibagikan antara menjalankan GWAS.

3.3.2 Seleksi sintetis post hoc
Untuk mengevaluasi bagaimana fitur digital bekerja relatif terhadap peringkat visual dalam hal seleksi, proyek seleksi sintetis post hoc dilakukan. Untuk ketahanan terhadap penyakit, seleksi ambang batas akan digunakan dengan mengidentifikasi galur dengan kinerja terburuk (paling rentan) dan membuangnya dari populasi. Di sini, 30 galur yang paling rentan dipilih dari total 264 galur. Ini mewakili 11% terburuk dari populasi. Karena peringkat visual adalah apa yang digunakan banyak pemulia tanaman untuk membuat seleksi saat ini, individu yang dipilih dan diberi peringkat dengan cara ini dianggap sebagai set kebenaran dasar (Gambar 9 , kolom tengah). Tiga fitur teratas yang ditentukan oleh model hutan ordinal keempat (bagian 3.2 ) digunakan untuk memaksakan seleksi pada populasi dan konsensus antara tiga fitur teratas dan peringkat visual ditabulasi. Dari 30 galur terburuk yang dipilih oleh peringkat visual, area lesi cocok dengan 16 pilihan, VARI cocok dengan 25 pilihan, dan pengguguran daun cocok dengan 24 pilihan. Gambar 9 menunjukkan bagaimana pengguguran daun dan VARI memberi peringkat 30 individu terburuk dibandingkan dengan peringkat visual standar. Percobaan seleksi ini mendukung pengguguran daun dan VARI sebagai proksi untuk penilaian visual LS.

4 KESIMPULAN
Fitur yang berasal dari penilaian visual tradisional, pemindaian daun dengan throughput rendah, citra RGB dengan throughput tinggi, dan citra multispektral dengan throughput tinggi dievaluasi dan dibandingkan dalam studi ini. Dari platform fenotipe yang dibandingkan, fenotipe berbasis UAV adalah yang paling menguntungkan karena mengurangi tenaga kerja manual, menghasilkan data objektif yang berkelanjutan dan menghasilkan data dengan cepat. Kelemahan utama fenotipe UAV adalah investasi awal dalam peralatan dan perangkat lunak. Selain platform fenotipe, fitur-fitur juga dibandingkan dalam pekerjaan ini. VARI dan pengguguran daun memiliki korelasi tertinggi dengan penilaian visual dan juga diperingkat sebagai dua fitur terpenting teratas untuk pemodelan penilaian visual. Secara khusus, VARI paling baik dalam memisahkan sembilan kelas penilaian visual. Baik VARI maupun pengguguran daun berasal dari sensor RGB. Eksperimen GWAS bukti konsep menunjukkan bahwa area lesi berbasis pemindai flatbed mengidentifikasi QTL yang sama dengan penilaian visual. Terakhir, proyek seleksi sintetis bukti konsep menunjukkan bahwa VARI dan pengguguran daun cocok dengan seleksi ambang batas yang dibuat oleh penilaian visual masing-masing sebesar 83% dan 80%. Pada akhirnya, hasil ini menunjukkan bahwa UAV yang dilengkapi dengan sensor RGB sesuai untuk menyediakan data fenotipe digital throughput tinggi pada LS dalam bentuk pengguguran daun atau VARI. Pengguguran daun memerlukan penerbangan pada dua titik waktu untuk mengukur perubahan kelimpahan tajuk, sementara VARI tidak memerlukan beberapa penerbangan. Oleh karena itu, VARI lebih mudah diimplementasikan dan merupakan proksi yang paling masuk akal untuk penilaian visual LS yang diidentifikasi dalam penelitian ini. Karena area lesi diidentifikasi sebagai fitur utama dan berkinerja baik dalam eksperimen bukti konsep GWAS, penelitian masa depan perlu dialokasikan untuk meningkatkan throughput fenotipe area lesi.